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单细胞遇上CRISPR筛选-大规模知识大发现时代来临

| 2019-07-12 阅读 86

人类基因组中有20000多个蛋白质编码基因,还有很多非编码RNA基因,包括微RNA。尽管我们已经知道了特定基因的某些功能,但我们仍然不知道每个基因的所有功能,也不知道许多基因在驱动或影响疾病中的作用。确定每个基因在不同正常和疾病过程中的功能是后基因组时代的主要目标之一。

目前两项技术的横空出世,将成为后基因组时代最有力的两项工具,一项便是单细胞技术,一项便是CRISPR筛选技术。近期来自于西奈山医学院的科学家们在Cell发表文章,利用飞行质谱将CRISPR与飞行质谱连用,获得多项重要突破,更为重要的是,开发了飞行质谱与CRISPR大规模筛选的研究范例,可以预测,在不遥远的将来,这项技术将在包括免疫等多种技术中起到中流砥柱的作用。


具体来看,首先看看什么是飞行质谱,和单细胞测序类似,都是希望在单细胞水平解析基因的表达,不过单细胞RNA测序,是了解基因RNA的表达,而飞行质谱则是利用抗体与重金属耦合,然后利用质谱测定多达40个不同表面分子的表达。利用这种方式,人们可以非常容易的区分很多基因的表达。而且是在蛋白水平。

我们知道一个一个的敲除基因然后观察表型非常的繁琐,在这项工作中,就是将飞行质谱与CRISPR筛选联用,观察每一个sgRNA对应的多种不同的表面biomarker的变化。

这项技术可以利用编码CRISPR导向RNA ( gRNA )或shRNA的载体敲除( KO )、敲除( KD )或过表达( OE )任何基因。然而,在不同的实验系统中,基因组中每个基因的KO、KD或OE都很麻烦、昂贵,而且非常耗时。对于体内研究来说,这更具挑战性,实际上也不可行。这导致越来越多的人使用集合遗传筛选,目的是在一个单一的实验系统中同时确定100个基因的功能。通过将DNA用于条形码载体,集合筛选成为可能。独特的核苷酸序列可以掺入载体中,或者,当载体编码shRNA或CRISPR gRNA时,shRNA或gRNA序列成为条形码( Bassik等人)。Shalem等人,2009年。2015年)。可以用100个载体同时转导细胞,携带每个载体的细胞频率可以通过深度测序来确定( Mullokandov等人)。2012年)。通过施加选择性压力,例如时间或药物,并测量与特定shRNA或gRNA相关的每个条形码的频率变化,可以推断特定基因的功能。


为了能够将特定的sgRNA靶向的基因能够直接被飞行质谱读取,科学家们非常聪明的利用一个被称为表位排列组合的工具,产生蛋白质条形码系统。能够克服当前集合筛选技术的许多限制。合成了编码14个不同线性表位的3个组合的序列,以产生364个前编码。编码表达载体被引入细胞中,可以同时检测所有364个亲编码表达细胞群体。通过将每一个Pro Code与不同的CRISPR gRNA配对,我们能够以单细胞分辨率分析数十个不同敲除。

基于这项系统,科学家们使用Pro -Code / CRISPR载体来筛选影响乳腺癌敏感性和抗抗原特异性T细胞杀伤的基因,并发现证据表明两种干扰素-γ(IFNγ)刺激的基因,免疫蛋白酶体成分psmb 8和rt4,对抗原依赖性免疫编辑很重要。还发现socs 1是免疫检查点Pd - L1的负调节因子。这项工作建立了一种新的条形码系统,能够以单细胞分辨率同时对100多个基因进行高维表型分析,有助于推进基因注释的广泛应用。

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